DNA 限制性內(nèi)切酶（簡稱限制酶）是一類能識(shí)別并切割雙鏈 DNA 特定核苷酸序列的酶，廣泛應(yīng)用于基因克隆、分子標(biāo)記、基因編輯等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。以下是一些常見的限制酶及其主要用途：

一、常見的限制性內(nèi)切酶及特性

1. EcoRI

識(shí)別序列：5'-GAATTC-3'（切割后產(chǎn)生 5' 粘性末端：-G 和 AATTC-）

來源：大腸桿菌（Escherichia coli RY13）

用途：

基因克隆中常用的工具酶，用于切割載體和目的基因，產(chǎn)生互補(bǔ)粘性末端以便連接。

構(gòu)建基因組文庫或 cDNA 文庫時(shí)的酶切處理。

2. HindIII

識(shí)別序列：5'-AAGCTT-3'（切割后產(chǎn)生 5' 粘性末端：-A 和 AGCTT-）

來源：流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae Rd）

用途：

與 EcoRI 類似，常用于載體和目的基因的酶切，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

用于 DNA 片段的限制性長度多態(tài)性（RFLP）分析，輔助基因定位或親子鑒定。

3. BamHI

識(shí)別序列：5'-GGATCC-3'（切割后產(chǎn)生 5' 粘性末端：-G 和 GATCC-）

來源：淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens H）

用途：

廣泛用于基因克隆中的酶切連接，尤其適用于構(gòu)建表達(dá)載體。

用于 DNA 甲基化分析（部分甲基化位點(diǎn)會(huì)抑制其切割活性）。

4. XhoI

識(shí)別序列：5'-CTCGAG-3'（切割后產(chǎn)生 5' 粘性末端：-C 和 TCGAG-）

來源：潮霉素鏈霉菌（Streptomyces xanthus）

用途：

常用于真核表達(dá)載體的構(gòu)建（如與載體上的 XbaI 等酶切位點(diǎn)配合）。

因切割產(chǎn)生的末端與 SalI（識(shí)別 GTCGAC）互補(bǔ)，可實(shí)現(xiàn)不同酶切片段的連接。

5. PstI

識(shí)別序列：5'-CTGCAG-3'（切割后產(chǎn)生 3' 粘性末端：-CTGCA 和 G-）

來源：普羅威登斯菌（Providencia stuartii 164）

用途：

用于質(zhì)粒載體的酶切（如 pBR322 的經(jīng)典酶切位點(diǎn)）。

在基因克隆中，3' 粘性末端可減少自身環(huán)化概率，提高重組效率。

6. Sau3AⅠ

識(shí)別序列：5'-GATC-3'（切割后產(chǎn)生 5' 粘性末端：-G 和 ATC-，與 BamHI 末端互補(bǔ)）

來源：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus 3A）

用途：

因識(shí)別 4 堿基序列（切割頻率高），常用于基因組 DNA 的隨機(jī)片段化，構(gòu)建小片段文庫。

可與 BamHI 切割的載體連接（末端互補(bǔ)），增加克隆靈活性。

7. SmaI

識(shí)別序列：5'-CCCGGG-3'（切割后產(chǎn)生平末端：-CCC 和 GGG-）

來源：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens Sb）

用途：

用于產(chǎn)生平末端的 DNA 片段，適用于平末端連接（如不同來源的平末端片段拼接）。

因平末端連接效率較低，常需配合 T4 DNA 連接酶使用。

8. NotI

識(shí)別序列：5'-GCGGCCGC-3'（切割后產(chǎn)生 5' 粘性末端：-GCGGCC 和 GC-）

來源：諾卡氏菌（Nocardia otitidis-caviarum）

用途：

識(shí)別 8 堿基序列（切割頻率低），常用于大片段 DNA 的酶切（如人工染色體載體 BAC、YAC 的構(gòu)建）。

用于保留目的基因完整序列（避免內(nèi)部被頻繁切割）。

二、限制酶的分類及選擇依據(jù)

限制酶按切割方式可分為粘性末端酶（如 EcoRI、HindIII）和平末端酶（如 SmaI），選擇時(shí)需考慮：

目的基因和載體上的酶切位點(diǎn)是否匹配（避免切割目的基因內(nèi)部）。

末端類型（粘性末端連接效率高于平末端）。

酶切條件（如溫度、緩沖液）是否兼容（多酶切時(shí)需選擇通用緩沖液）。

三、延伸應(yīng)用

除上述基礎(chǔ)用途外，限制酶還用于：

基因編輯驗(yàn)證：切割 CRISPR/Cas9 編輯后的 DNA，通過電泳檢測是否成功插入 / 缺失片段。

甲基化分析：部分酶（如 HpaII）對(duì)甲基化位點(diǎn)敏感，可用于檢測 DNA 甲基化狀態(tài)。

選擇時(shí)需結(jié)合實(shí)驗(yàn)需求（如片段大小、連接效率）和酶的特異性，參考供應(yīng)商提供的酶切位點(diǎn)圖譜和反應(yīng)條件。

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